Tópico 2. MÉTODOS DE PESQUISA EM HISTOLOGIA. PREPARAÇÃO DA PREPARAÇÃO HISTOLÓGICA

O principal método de pesquisa em histologia é a microscopia - o estudo de preparações histológicas sob um microscópio. Recentemente, a microscopia foi combinada com outros métodos - histoquímica e historradiografia. Para microscopia, são utilizados vários desenhos de microscópios, que permitem estudar vários parâmetros de preparações histológicas.

Os seguintes tipos de microscopia são distinguidos:

1) microscopia de luz (o tipo mais comum de microscopia, enquanto a resolução do microscópio é de 0,2 mícrons);

2) microscopia ultravioleta (a resolução do microscópio é de 0,1 mícron);

3) microscopia luminescente (utilizada para determinar determinadas estruturas químicas no espécime histológico em estudo);

4) microscopia de contraste de fase (usada para detectar e estudar certas estruturas em preparações histológicas não coradas);

5) microscopia polarizadora (utilizada principalmente para estudar estruturas fibrosas);

6) microscopia de campo escuro é usada para estudar objetos vivos;

7) microscopia de luz incidente (projetada para estudar objetos espessos);

8) microscopia eletrônica (o tipo mais moderno de microscopia com resolução de 0,1 - 0,7 nm). Existem dois tipos de microscopia eletrônica - microscopia de transmissão (transmissão) e de varredura (ou solução), que exibe ultraestruturas de superfície.

Métodos histológicos e citoquímicos são usados ​​para determinar a composição de produtos químicos e sua quantidade em determinadas estruturas. O princípio do método reside na reação química entre o reagente e o substrato contido na substância-teste. Neste caso, os subprodutos resultantes da reação podem ser detectados usando microscopia de luz ou luminescente.

O método de histoautorradiografia permite revelar a composição de substâncias químicas nas estruturas em estudo e a intensidade da troca pela inclusão de isótopos radioativos. Este método é mais frequentemente usado em experimentos com animais.

O método de interferonometria permite determinar a massa seca de uma substância em objetos vivos ou fixos.

O método de cultura de células é o cultivo de células em tubos de ensaio ou em cápsulas especiais no corpo e o subsequente exame de células vivas ao microscópio.

O método de coloração vital é a introdução de um corante (azul de trepan) no sangue ou na cavidade abdominal do animal, que durante a vida do animal é capturado por certas células - macrófagos, e após o abate do animal e a preparação do fármaco, as células contendo o corante são determinadas e contadas.

Os métodos imunomorfológicos permitem usar reações imunes preliminares (baseadas na interação antígeno-anticorpo) para determinar a subpopulação de linfócitos, o grau de estranheza das células, realizar a tipagem histológica de tecidos e órgãos, ou seja, determinar sua histocompatibilidade para transplante posterior.

O método de centrifugação diferencial é o estudo de organelas individuais ou mesmo seus fragmentos isolados de uma célula. Para fazer isso, um pedaço do órgão em estudo é esfregado, preenchido com solução salina e depois disperso em uma centrífuga em várias velocidades (de 2 a 150 mil por 1 min). Como resultado da centrifugação, são obtidas frações de interesse, que são então estudadas por vários métodos.

Métodos de morfometria - métodos quantitativos. Eles permitem determinar o tamanho e o volume do núcleo - cariometria, células - citometria, organelas - morfometria eletrônica, bem como determinar o número de células de várias populações e subpopulações. Esses métodos são amplamente utilizados em pesquisas científicas.

Vários métodos experimentais - carga de alimentos e água, métodos físicos (UHF, microondas, lasers, ímãs). Eles são usados ​​para estudar a reação de estruturas de interesse a um determinado impacto e são combinados com os métodos de morfometria, cito- e histoquímica. Esses métodos também são usados ​​em pesquisas científicas.

Assim, o principal e mais comum método de estudo em histologia é a microscopia. A preparação de uma preparação histológica inclui as seguintes etapas.

1. Pegando material - um pedaço de tecido ou órgão. Ao levar o material, as seguintes regras devem ser observadas:

1) a amostragem deve ser realizada o mais rápido possível após a morte ou abate do animal, se possível de um objeto vivo, a fim de preservar ao máximo a estrutura das células em estudo;

2) a amostragem do material deve ser realizada com instrumento cortante para não ferir os tecidos;

3) a espessura da peça não deve ultrapassar 5 mm, para que a solução fixadora penetre em toda a profundidade do tecido;

4) é necessário marcar a peça, indicando o nome do corpo, o número do animal ou o nome da pessoa, a data da amostragem.

2. Fixação do material. Esta etapa é realizada para interromper os processos metabólicos na célula e salvá-la da decomposição. Para fazer isso, um pedaço de tecido retirado para exame é imerso em uma solução de fixação. A solução pode ser simples (álcool ou formalina) e complexa (solução de Carnoy, fixador de Zinker). O fixador provoca a desnaturação das proteínas e mantém a estrutura celular em estado próximo da vida. A fixação também pode ser realizada por congelamento - resfriamento com nitrogênio líquido ou jato de dióxido de carbono.

3. Despejar pedaços de tecido em meios de vedação (parafina, resinas) - ou congelamento. Esta etapa é necessária para, posteriormente, fazer um corte fino do tecido em estudo.

4. Preparação de cortes em micrótomo ou ultramicrótomo com facas especiais. Depois disso, seções para microscopia de luz são coladas em lâminas de vidro e, para microscopia eletrônica, são montadas em grades especiais.

5. Coloração de cortes ou seu contraste (para microscopia eletrônica). Antes de colorir as seções, é necessário remover o meio de vedação - para realizar a desparasitação. Com a ajuda da coloração, o contraste das estruturas estudadas é alcançado. Os corantes podem ser divididos em básicos, ácidos e neutros. Os mais utilizados são os corantes básicos (hematoxilina) e ácidos (eosina). Corantes complexos também são frequentemente usados.

6. Limpeza de seção em xileno e tolueno. São encapsulados em resinas (bálsamo e poliestireno) e cobertos com lamínula.

Após esses procedimentos, a droga pode ser examinada sob um microscópio de luz. Seções de microscópio de luz colocadas sob vidro podem ser armazenadas por um longo tempo e reutilizadas. Para a microscopia eletrônica, cada seção é utilizada apenas 1 vez, enquanto é fotografada, e o estudo das estruturas teciduais é realizado de acordo com o padrão de difração de elétrons.

Se o tecido tiver uma consistência líquida (por exemplo, sangue, medula óssea), a preparação é feita na forma de um esfregaço em uma lâmina de vidro, que também é fixada, corada e estudada.

A partir de órgãos parenquimatosos frágeis, preparações são feitas na forma de uma impressão de órgão, esse órgão é fraturado e, em seguida, uma lâmina de vidro é aplicada no local da fratura, na qual as células livres são coladas. Depois disso, a droga é fixada e estudada.

A partir de alguns órgãos (por exemplo, o mesentério, pia-máter) ou de tecido conjuntivo fibroso frouxo, preparam-se filmes por estiramento ou esmagamento entre dois vidros, seguido de fixação e vazamento em resinas.

Autores: Selezneva T.D., Mishin A.S., Barsukov V.Yu.

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